注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
鄰二標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml,溶劑：甲)Acetyl-Histone H3 (Lys9) (C5B11) Rabbit mAb (PE Conjuga)芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-1-叔丁酯

鄰二(標(biāo)準(zhǔn)品)Survivin Antibody雙-（1，5-環(huán)辛二）鎳

1,2-二烷(標(biāo)準(zhǔn)品)Hexokinase I Antibody3,5-二氟甲酰

鄰二甲酸二酯(標(biāo)準(zhǔn)品)SH2D1A (XLP 1D12) Rat mAbN-1-Boc-2-哌甲酸甲酯

二異(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99.5%(GC))WAVE-3 Antibody氧化銀

間二(分析標(biāo)準(zhǔn)品,用于環(huán)境分析)Complexin-1/2 (D8A6E) Rabbit mAb氨甲基四氫吡喃

鄰二甲酸二正辛酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml,基體：甲)INCENP (P240) Antibody四酰核糖

鄰二甲酸二正辛酯(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99%(GC))Survivin (71G4B7) Rabbit mAb5-酰氨基-7,8,9-O-三酰基-2,6-脫水-疊氮-3,4,5-三脫氧-D-甘油-D-半-2-壬酸甲酯

鄰二甲酸二環(huán)己酯(標(biāo)準(zhǔn)品)Survivin (71G4B7) Rabbit mAb溴甲基

4,4'-二氨基二(標(biāo)準(zhǔn)品)Survivin (71G4B7) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)N-芐氧羰基-去甲托品酮

鄰二甲酸二壬酯(標(biāo)準(zhǔn)品)SET7/SET9 Antibody氧化鏑

鄰二甲酸二正戊酯(標(biāo)準(zhǔn)品)SET7/SET9 Antibody3'-羥基酮

鄰二甲酸二丁酯(標(biāo)準(zhǔn)品)RecQ4 Antibody氫氧化

鄰二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(200ug/ml,基體：甲)Grp75 Antibody氫氧化鋰

2,二氨(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99%)MLK3 Antibody2,6-二氨基蒽醌

3,3'-二甲氧基聯(lián)(標(biāo)準(zhǔn)品)Cripto Antibody (Mouse Specific)氧化銦

2，二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.00mg/ml,基體：甲)Bim Antibody三氧化鉬

2,6-二酚(標(biāo)準(zhǔn)品)Ring1A AntibodyBOC-L-亮氨酸

犬KI-67抗原(MKI67)ELISA試劑盒Neuropilin-2  神經(jīng)纖毛蛋白-2100 ul

犬I 型膠原蛋白ELISA試劑盒NRSF/REST  神經(jīng)元抑制蛋白100 ul

犬E選擇素(SELE)ELISA試劑盒NSBP1  核小體結(jié)合蛋白120 ul

犬C肽(C-Peptide)ELISA試劑盒NSE  神經(jīng)元特異性醇化酶100 ul

犬C反應(yīng)蛋白(CRP)ELISA試劑盒NT-3  神經(jīng)營養(yǎng)因子-3100 ul

犬CD8分子(CD8)ELISA試劑盒NT-4/NT-5  神經(jīng)生長因子4/520 ul

犬CD6分子(CD6)ELISA試劑盒MT-ND1  NADH復(fù)合體1100 ul

犬CD4分子(CD4)ELISA試劑盒NTCP  鈉離子/牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白100 ul

犬CD31分子(CD31)ELISA試劑盒Neurturin  神經(jīng)生長因子100 ul
鴨瘟病毒PCR檢測試劑盒規(guī)格無精癥缺失基因1抗體3,4-Secotirucalla-4(28),7,24-triene-3,26-dioic acid中文名：別名：分子式：C30H46O4

甲狀腺素5'脫酶3抗體Glochidiol中文名：別名：20(29)-Lupene-1,3-diol分子式：C30H50O2

DNA聚合酶θ/DNA pol θ抗體Actein中文名：阿克特素別名：分子式：C37H56O11

磷酸化D酪氨酸激酶衰減蛋白1抗體Erythrodiol 3-palmitate中文名：別名：分子式：C46H80O3

磷酸化形態(tài)發(fā)生紊亂關(guān)聯(lián)激活因子1抗體Betulin palmitate中文名：別名：分子式：C46H80O3
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。